猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）是引起猪Sus scrofa圆环病毒相关综合征（PCVAD）的主要病原体之一，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、母猪繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合症（PRDC）、猪皮炎与猪肾病综合症（PDNS）、肠炎和先天性震颤等疾病［1－2］。PCV2对外界和一般消毒剂的抵抗力较强，在酸性环境及氯仿中可以存活较长时间甚至在高温环境（72℃）也能存活一段时间。PCV2易通过胎盘垂直传播，感染猪群的免疫功能下降后发病，常与猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）或猪细小病毒（PPV）混合感染，也易继发猪副嗜血杆菌或猪链球菌2型感染［3］。PCV2主要感染哺乳期和育成期的仔猪，尤其5～12周龄仔猪特别易感，常并发或继发细菌感染而导致死亡率大大增加［4］。PCV2最早发现于加拿大，后蔓延至美国、西班牙、英国、丹麦、德国、荷兰、比利时、日本和韩国等，发病率为10%～80%，死亡率为15%～30%［5］。PCV2在中国猪群中早已存在，2002年后发病猪群逐渐增多，死亡率为20%～30%［6－7］。临床上防控该病主要采用疫苗接种方法，虽然控制了大规模流行的趋势，但是一些饲养管理不当的养殖场仍然存在较高的发病率。为及时诊断该疾病，及早接种疫苗和加强生物安全措施，亟需建立起一种高灵敏性、快速高效的检测方法，以减少疾病所导致的损失。实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）技术是一种简单、快速、灵敏度高的检测技术，应用到动物疫病诊断上，主要采用基于SYBR Green I和Taqman探针的2种荧光定量检测方法，相比而言，Taqman探针灵敏性更高。因此，本研究拟利用针对PCV2的ORF1基因特异引物和TaqMan探针，建立一种实时荧光定量PCR检测技术，为PCV2的实验室诊断和疫病预警预报提供检测工具。

1 材料和方法

1.1 病毒

猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）均由浙江农林大学动物预防医学与公共卫生实验室保存，猪流行性腹泻病毒（PEDV）-猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）-轮状病毒（RV）三联疫苗购自哈尔滨维科生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物与探针的设计 从GenBank中下载PCV2特异性的ORF1基因（Genbank：MF.1）序列，利用Beacon Designer 7软件找出该基因上的高保守序列，设计1对特异引物和1条带有FAM（6-羧基荧光素）标记和碎灭为MGB（Minor Groove Binder，小沟结合物）的Taqman探针。上游引物（ORF1-F）序列：5′-TAGATCTCAAGGACAACGGAGTGA-3′； 下游引物（ORF1-R）序列：5′-GTTACAGGGTGCTGCTCTGCA-3′；探针序列：5′-FAM-CAGACTCCCGCTCTC-MGB-NFQ-3′。所有序列均由上海金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 阳性质粒标准品的构建 应用特异引物（ORF1-F/R），以PCV2的DNA为模板进行PCR扩增。反应条件为94℃ 5 min；98℃ 10 s，60℃30 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃ 10 min，15℃ 5 min。利用DNA凝胶回收试剂盒（上海生工生物有限公司）纯化回收PCR产物，连接至pMD18-T（大连宝生物工程有限公司）克隆载体后，转化大肠埃希菌Escherichia coli（DH5α）感受态细胞。经蓝白斑筛选得到阳性克隆，用菌落PCR和质粒PCR鉴定获得阳性重组质粒（命名为pSL1353），送生物公司（上海金唯智生物科技有限公司）测序验证。所获质粒经核酸蛋白浓度测定仪测定浓度和纯度，置于－20℃备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR反应条件的优化 配制实时荧光定量PCR的反应体系，其中上、下游引物各0.4 μL， SYBRPremix μL， 模板（pSL1353） 2.0 μL， 超纯水补足至 20.0 μL。 对反应条件进行优化，分别设置退火温度为54，56，58，60和62℃，以获得该方法的最佳退火温度。分别采用0.2，0.3，0.4和0.5 μmol·L－1的引物浓度，构建PCR反应体系，确定该方法的最佳引物浓度。采用0.1， 0.2， 0.3， 0.4 和 0.5 μmol·L－1的探针浓度， 上、 下游引物各 0.4 μL， rTaq酶和 dNTP 混合物 10.0μL，模板（pSL1353，超纯水为空白对照）2.0 μL，超纯水补足至20.0 μL，确定最佳Taqman探针浓度。

1.2.4 实时荧光定量PCR反应标准曲线建立及线性范围 将1.2.2得到的pSL1353质粒以10倍梯度稀释成 1013， 1012， 1011， 1010， 109， 108， 107和 106拷贝·L－1； 以 1.2.3 得到的优化条件进行荧光定量 PCR扩增，重复3次·浓度－1；以阳性重组质粒拷贝数为横坐标，以各浓度下的循环数（Ct）值为纵坐标，建立Taqman探针实时荧光定量PCR 标准曲线。 其中拷贝数计算公式： 拷贝数（拷贝·L－1）＝质粒浓度（g·L－1）×阿弗加德罗常数/重组质粒分子量［8］。